Keskeinen ero - PCR vs. DNA-sekvensointi
PCR ja DNA-sekvensointi ovat kaksi tärkeää tekniikkaa molekyylibiologiassa. Polymeraasiketjureaktio (PCR) on prosessi, joka luo suuren määrän kopioita DNA-fragmentista. DNA-sekvensointi on tekniikka, joka johtaa tietyn DNA-fragmentin nukleotidien tarkkaan järjestykseen. Tämä on keskeinen ero PCR: n ja DNA-sekvensoinnin välillä. PCR on yksi tärkeimmistä vaiheista DNA-sekvensoinnissa.
SISÄLLYSLUETTELO
1. Yleiskatsaus ja keskeinen ero
2. Mikä on PCR
3. Mikä on DNA-sekvensointi
4. Vertailu rinnakkain - PCR vs. DNA-sekvensointi
5. Yhteenveto
Mikä on PCR?
Polymeraasiketjureaktio (PCR) on molekyylibiologiassa käytetty DNA-monistusmenetelmä. Se tuottaa tuhansista miljooniin kopioita tietystä DNA-fragmentista. Tämän menetelmän on kehittänyt Kary Mullis vuonna 1983. Tässä tekniikassa amplifioitava DNA-fragmentti toimii templaattina ja DNA-polymeraasientsyymi lisää komplementaarisia nukleotideja alukkeeseen, joka on saatavana PCR-seoksessa. PCR-reaktion lopussa syntetisoidaan monia kopioita näyte-DNA: sta.
PCR-seoksessa on erilaisia komponentteja, mukaan lukien DNA, DNA-polymeraasi (Taq-polymeraasi), alukkeet (eteenpäin ja taaksepäin olevat alukkeet), nukleotidit (DNA: n rakennuspalikat) ja puskuri. PCR tapahtuu PCR-koneen sisällä, ja oikea PCR-seos tulisi ladata koneeseen ja ajaa oikea ohjelma. Tämä tekniikka mahdollistaa tuhansien miljoonien kopioiden tuottamisen tietystä DNA-osasta hyvin pienestä määrästä DNA: ta.
PCR-reaktiot tapahtuvat syklisesti, jotta saadaan aikaan näkyvä määrä PCR-tuotteita geelillä. PCR-reaktiossa on kolme päävaihetta, nimittäin denaturointi, alukkeen hehkutus ja juosteen jatkaminen, kuten kuvassa 01 on esitetty. Nämä kolme vaihetta tapahtuvat kolmessa eri lämpötilassa. DNA esiintyy kaksisäikeisessä muodossa vetysidoksilla komplementaaristen emästen välillä. Ennen implikaatiota kaksijuosteinen DNA tulisi erottaa toisistaan. Se tehdään antamalla korkea lämpötila. Korkeassa lämpötilassa kaksisäikeinen DNA denaturoituu yksisäikeisiksi. Sitten alukkeiden tulisi tulla lähemmäs tietyn fragmentin tai DNA-geenin reunustavia päitä. Primer on lyhyt kappale yksijuosteista DNA: ta, joka täydentää kohdesekvenssiä. Eteenpäin ja taaksepäin olevat alukkeet hehkutuvat komplementaaristen emästen kanssa denaturoidun näyte-DNA: n reunustavissa päissä hehkutuslämpötilassa. Pohjustusaineiden tulee olla lämmönkestäviä. Kun alukkeet hehkuvat näyte-DNA: lla, taq-polymeraasientsyymi aloittaa uusien säikeiden synteesin lisäämällä nukleotideja, jotka ovat komplementaarisia kohde-DNA: lle. Taq-polymeraasi on lämpöstabiili entsyymi, joka on eristetty termofiilisestä bakteerista nimeltä Thermus aquaticus. PCR-puskuri ylläpitää optimaaliset olosuhteet taq-polymeraasitoiminnalle. Nämä kolme PCR-reaktiovaihetta toistetaan tarvittavan määrän PCR-tuotteen tuottamiseksi. Jokaisen PCR-reaktion jälkeen DNA-kopion määrä kaksinkertaistuu. Näin ollen PCR: ssä voidaan havaita eksponentiaalinen monistus. PCR-tuotteita voidaan havaita käyttämällä geelielektroforeesia ja ne voidaan puhdistaa jatkotutkimuksia varten.
Kuva 01: PCR-reaktion päävaiheet
PCR on arvokas työkalu lääketieteellisessä ja biologisessa tutkimuksessa. PCR: llä on erityinen arvo rikosteknologiassa, koska se voi monistaa DNA: ta tutkimuksia varten rikollisten pienistä näytteistä ja tehdä rikosteknisiä DNA-profiileja. PCR: ää käytetään laajalti monilla molekyylibiologian aloilla, mukaan lukien genotyypitys, geenikloonaus, mutaation havaitseminen, DNA-sekvensointi, DNA-mikrokerrat ja isyyden testaus jne.
Kuva 02: Polymeraasiketjureaktio
Mikä on DNA-sekvensointi?
DNA-sekvensointi on nukleotidien - adeniinin, guaniinin, sytosiinin ja tymiinin - tarkan järjestyksen määrittäminen tietyssä DNA-fragmentissa. Geneettinen informaatio tallennetaan DNA-sekvensseihin käyttäen nukleotidien oikeaa järjestystä. Siksi nukleotidien tarkan järjestyksen löytäminen DNA-fragmentista on erittäin tärkeää tietää geenien rakenteesta ja toiminnasta.
DNA-sekvensointiprotokolla sisältää erilaisia prosesseja. Ensimmäinen vaihe on kiinnostavan DNA: n tai organismin genomisen DNA: n eristäminen. Käyttämällä PCR: ää (kuten yllä on kuvattu), haluttu DNA-alue tulisi monistaa. Monistettu PCR-tuote tulisi erottaa geelielektroforeesilla ja puhdistaa. Monistetut fragmentit tarjoillaan malleina sekvensoinnissa. Sekvensointi voidaan suorittaa joko Sanger-sekvensoinnin tai korkean suorituskyvyn sekvensointimenetelmän avulla. Sanger-sekvensointi vaatii saatujen DNA-fragmenttien kapillaarielektroforeesin. Oikean nukleotidijärjestyksen määrittäminen voidaan tehdä lukemalla autoradiografit manuaalisesti tai käyttämällä automaattisia DNA-sekvenssereitä.
Geenisekvensointi vaikutti ihmisen genomiprojektiin ja helpotti ihmisen perimän kartoittamista vuonna 2003. Rikosteknologiassa DNA-sekvensointi mahdollisti yksilöiden tunnistamisen, joilla on ainutlaatuisia DNA-sekvenssejä ja tunnistettiin rikolliset. Lääketieteessä DNA-sekvensointia voidaan käyttää geneettisistä ja muista sairauksista vastaavien geenien havaitsemiseksi, vikageenien löytämiseksi ja korvaamiseksi oikeilla geeneillä. Maataloudessa joidenkin mikro-organismien DNA-sekvensointitietoja käytetään siirtogeenisten kasvien tuottamiseen, joilla on taloudellisesti halutut ominaisuudet.
Kuva 03: DNA-sekvensointi
Mikä on ero PCR: n ja DNA-sekvensoinnin välillä?
Erilainen artikkeli keskellä taulukkoa
PCR vs. DNA-sekvensointi |
|
| PCR-prosessi luo tuhansista miljooniin kopioita kiinnostuneesta DNA-fragmentista. | DNA-sekvensointi on prosessi, jolla määritetään nukleotidien tarkka järjestys tietyssä DNA-fragmentissa. |
| Tulokset | |
| PCR luo tuhansista miljooniin kopioita tietystä DNA-fragmentista | Tämä johtaa emästen oikeaan järjestykseen tietyssä DNA-fragmentissa. |
| DdNTP: n osallistuminen | |
| PCR ei vaadi ddNTP: itä. Se käyttää dNTP: itä. | DNA-sekvensointi vaatii ddNTP: itä säikeiden muodostumisen lopettamiseksi. |
Yhteenveto - PCR vs. DNA-sekvensointi
PCR ja DNA-sekvensointi ovat erittäin tärkeitä työkaluja monilla molekyylibiologian alueilla. DNA-fragmenttien amplifikaatio suoritetaan PCR-tekniikalla, kun taas DNA-fragmenttien nukleotidien oikea järjestys määritetään DNA-sekvensoinnilla. Tämä on ero PCR: n ja DNA-sekvensoinnin välillä.
