Tärkein ero - NGS vs. Sanger-sekvensointi
Seuraavan sukupolven sekvensointi (NGS) ja Sanger-sekvensointi ovat kahden tyyppisiä nukleotidisekvensointitekniikoita, jotka on kehitetty ajan myötä. Sanger-sekvensointimenetelmää käytettiin laajalti monien vuosien ajan, ja NGS korvasi sen äskettäin sen etujen vuoksi. Keskeinen ero NGS: n ja Sanger-sekvensoinnin välillä on se, että NGS toimii periaatteella sekvensoida miljoonia sekvenssejä samanaikaisesti nopeasti sekvensointijärjestelmän kautta, kun taas Sanger-sekvensointi toimii ketjun lopettamisen periaatteella johtuen dideoksynukleotidien selektiivisestä sisällyttämisestä DNA-polymeraasientsyymiin DNA-replikaation ja tuloksena olevan fragmentin erottamisen aikana kapillaarielektroforeesilla.
SISÄLLYSLUETTELO
1. Yleiskatsaus ja keskeinen ero
2. Mikä on nukleotidisekvensointi
3. Mikä on NGS
4. Mikä on Sanger-sekvensointi
5. Rinnakkainen vertailu - NGS vs. Sanger-sekvensointi
6. Yhteenveto
Mikä on nukleotidisekvensointi?
Geneettinen informaatio tallennetaan organismin DNA: n tai RNA: n nukleotidisekvensseihin. Prosessi nukleotidien oikean järjestyksen määrittämiseksi (käyttäen neljää emästä) tietyssä fragmentissa (geenissä, geeniryhmässä, kromosomissa ja täydellisessä genomissa) tunnetaan nukleotidisekvensointina. Geenien rakenteen ja toiminnan analysointi on erittäin tärkeää genomisissa tutkimuksissa, oikeuslääketieteellisissä tutkimuksissa, virologiassa, systemaattisessa biologisessa tutkimuksessa, lääketieteellisessä diagnoosissa, biotekniikassa ja monilla muilla aloilla. Tutkijoiden kehittämiä sekvensointimenetelmiä on erilaisia. Niistä Frederick Sangerin vuonna 1977 kehittämää Sanger-sekvensointia käytettiin laajalti ja sitä popularisoitiin pitkään, kunnes Next Generation Sequencing korvasi sen.
Mikä on NGS?
Seuraavan sukupolven sekvensointi (NGS) on termi, jota käytetään viittaamaan moderneihin korkean suorituskyvyn sekvensointiprosesseihin. Siinä kuvataan useita erilaisia moderneja sekvensointitekniikoita, jotka mullistivat genomitutkimukset ja molekyylibiologian. Nämä tekniikat ovat Illumina-sekvensointi, Roche 454-sekvensointi, Ion-protonisekvensointi ja SOLiD-sekvensointi (Sequencing by Oligo Ligation Detection). NGS-järjestelmät ovat nopeampia ja halvempia. NGS-järjestelmissä käytetään neljää pääasiallista DNA-sekvensointimenetelmää, nimittäin; pyrosekvensointi, sekvensointi synteesillä, sekvensointi ligaatiolla ja ionipuolijohtosekvensointi. Suuri määrä DNA- tai RNA-juosteita (miljoonia) voidaan sekvensoida rinnakkain. Se mahdollistaa sekvensoinnin koko organismien genomista lyhyessä ajassa, toisin kuin Sanger-sekvensointi, joka vie enemmän aikaa.
NGS: llä on monia etuja perinteiseen sekvensointimenetelmään verrattuna. Se on nopea, tarkempi ja kustannustehokkaampi prosessi, joka voidaan suorittaa pienellä otoskokolla. NGS: ää voidaan käyttää metagenomisissa tutkimuksissa, yksittäisen genomin sisäisten ja deleetioiden jne. Aiheuttamien variaatioiden havaitsemisessa ja geeniekspressioiden analysoinnissa.
Kuva_1: NGS-sekvensoinnin kehitys
Mikä on Sanger-sekvensointi?
Sangerin sekvensointi on sekvensointimenetelmä, jonka Frederick Sanger ja hänen kollegansa kehittivät vuonna 1977 tietyn DNA-fragmentin tarkan nukleotidijärjestyksen määrittämiseksi. Se tunnetaan myös nimellä ketjun lopetussekvensointi tai dideoksisekvensointi. Tämän menetelmän toimintaperiaate on juosteen synteesin lopettaminen lisäämällä selektiivisesti ketjun päättävät dideoksinukleotidit (ddNTP: t), kuten ddGTP, ddCTP, ddATP ja ddTTP DNA-polymeraasilla DNA: n replikaation aikana. Normaaleissa nukleotideissa on 3'-OH-ryhmät vierekkäisten nukleotidien välisen fosfodiesterisidoksen muodostamiseksi juosteen muodostumisen jatkamiseksi. DdNTP: stä puuttuu kuitenkin tämä 3'-OH-ryhmä, eivätkä ne pysty muodostamaan fosfodiesterisidoksia nukleotidien välille. Siksi ketjun venymä loppuu.
Tässä menetelmässä sekvensoitava yksisäikeinen DNA toimii templaattina juosteena in vitro -DNA-synteesissä. Muita vaatimuksia ovat oligonukleotidialuke, deoksinukleotidien esiasteet ja DNA-polymeraasientsyymi. Kun kohdefragmentin reunukset ovat tunnettuja, alukkeet voidaan helposti suunnitella DNA-replikaatiota varten. Neljä erillistä DNA-synteesireaktiota suoritetaan neljässä erillisessä putkessa. Jokaisessa putkessa on erilliset ddNTP: t yhdessä muiden vaatimusten kanssa. Kyseisestä nukleotidista lisätään dNTP: n ja ddNTP: n seos. Samoin suoritetaan neljä erillistä reaktiota neljässä putkessa neljällä seoksella. Reaktioiden jälkeen suoritetaan DNA-fragmenttien havaitseminen ja fragmenttikuvion muuntaminen sekvenssitiedoksi. Tuloksena olevat DNA-fragmentit denaturoidaan ja erotetaan geelielektroforeesilla. Jos käytetään radioaktiivisia nukleotideja, polyakryyliamidigeelin nauhakuvio voidaan visualisoida autoradiografialla. Kun tässä menetelmässä käytetään fluoresoivasti leimattuja dideoksinukleotideja, sitä voidaan lieventää luettua geeliä ja viedä se lasersäteen läpi fluoresoivan detektorin havaitsemiseksi. Jotta vältetään virheet, joita saattaa ilmetä, kun silmä lukee sekvenssin ja syöttää ne manuaalisesti tietokoneeseen, tämä menetelmä kehitettiin automaattisen sekvensserin käyttöön yhdessä tietokoneen kanssa. Jotta vältetään virheet, joita saattaa ilmetä, kun silmä lukee sekvenssin ja syöttää ne manuaalisesti tietokoneeseen, tämä menetelmä on kehitetty automaattisen sekvensserin käyttöön yhdessä tietokoneen kanssa. Jotta vältetään virheet, joita saattaa ilmetä, kun silmä lukee sekvenssin ja syöttää ne manuaalisesti tietokoneeseen, tämä menetelmä kehitettiin automaattisen sekvensserin käyttöön yhdessä tietokoneen kanssa.
Tätä menetelmää käytetään DNA: n sekvensointiin Human Genome -projektista. Tätä menetelmää käytetään edelleen edistyneillä muutoksilla, koska se antaa tarkat sekvenssitiedot huolimatta siitä, että se on kallis ja hidas prosessi.
Kuva_2: Sangerin sekvensointi
Mitä eroa on NGS: llä ja Sanger-sekvensoinnilla?
Erilainen artikkeli keskellä taulukkoa
NGS vs. Sangerin sekvensointi |
|
| Seuraavan sukupolven sekvensointi (NGS) viittaa nykyaikaisiin korkean suorituskyvyn sekvensointiprosesseihin. Siinä kuvataan useita erilaisia moderneja sekvensointitekniikoita | Sangerin sekvensointi on sekvensointimenetelmä, jonka Frederick Sanger on kehittänyt tietyn DNA-fragmentin tarkan nukleotidijärjestyksen määrittämiseksi. |
| Kustannustehokkuus | |
| NGS on halvempi prosessi, koska se vähentää aikaa, ihmisen voimaa ja kemikaaleja. | Tämä on kallista prosessia, koska se vie aikaa, ihmisen voimaa ja enemmän kemikaaleja. |
| Nopeus | |
| Tämä on nopeampaa, koska sekä kemiallinen että monien säikeiden signaalin havaitseminen tapahtuu rinnakkain. | Tämä on aikaa vievää, koska kemiallinen havaitseminen ja signaalin havaitseminen tapahtuu kahtena erillisenä prosessina ja vain säikeet voivat lukea kerrallaan. |
| Luotettavuus | |
| NGS on luotettava. | Sanger-sekvensointi on vähemmän luotettavaa |
| Otoskoko | |
| NGS vaatii vähemmän DNA: ta. | Tämä menetelmä tarvitsee suuren määrän templaatti-DNA: ta. |
| DNA-emäkset sekvensoitua fragmenttia kohden | |
| DNA-emästen määrä sekvensoitua fragmenttia kohden on pienempi kuin Sanger-menetelmä | Generointisekvenssit ovat pitempiä kuin NGS-sekvenssit. |
Yhteenveto - NGS vs. Sangerin sekvensointi
NGS ja Sangerin sekvensointi ovat nukleotidisekvensointitekniikoita, joita käytetään laajasti molekyylibiologiassa. Sanger-sekvensointi on varhainen sekvensointimenetelmä, joka korvattiin NGS: llä. Suurin ero NGS: n ja Sanger-sekvensoinnin välillä on, että NGS on nopea, tarkempi ja kustannustehokkaampi prosessi kuin Sanger-sekvensointi. Molemmat tekniikat loivat merkittäviä taudinpurkauksia genetiikassa ja biotekniikassa.
