Tärkein ero - kloonaus vs. alakloonaus
Kloonaus ja alakloonaus ovat molekyylibiologisia menettelyjä, jotka luovat geneettisesti identtisiä kiinnostavan DNA: n tai geenin sisältäviä soluja tai organismeja. Kloonaus on tekniikka, joka sisältää kiinnostuksen kohteena olevan geenin tai DNA: n insertoinnin vektoriin, sen replikaation isäntäbakteerissa ja sellaisten solujen tai organismien tuottamisen, jotka ovat tarkkoja kopioita geneettisestä koostumuksesta. Subkloonaus on tekniikka, joka sisältää kiinnostuksen kohteena olevan geenin, joka on jo insertoitu vektoriin, insertoimisen sekundääriseen vektoriin, sen replikaation isäntäbakteerissa ja geneettisesti identtisten solujen tai organismien kopioiden tuottamisen. Keskeinen ero kloonauksen ja alakloonauksen välillä on, että kloonauksessa kiinnostuksen kohteena oleva geeni, kun se on ligoitu vektoriin, jatkaa kloonausprosessia samalla kun alakloonauksessa,jo mielenkiinnon kohteena oleva kloonattu geeni erotetaan emovektorista ja insertoidaan uudelleen vastaanottajavektoriin ja jatketaan prosessia.
SISÄLLYSLUETTELO
1. Yleiskatsaus ja keskeinen ero
2. Mikä on kloonaus
3. Mikä on alakloonaus
4. Vertailu rinnakkain - kloonaus vs. alakloonaus
5. Yhteenveto
Mikä on kloonaus?
Kloonaus on menettely, joka tuottaa geneettisesti identtisiä organismeja tai soluja. Luonnossa kloonaus tapahtuu aseksuaalisen lisääntymisen keinoin. Kun geneettistä rekombinaatiota tai muutosta ei ole, tytärsolut saavat saman vanhemman geneettisen rakenteen. Prokaryoottiset ja eukaryoottiset organismit luovat klooneja binaarifissiolla, orastumisella, mitoosilla jne. Molekyylibiologiassa geenien tai spesifisten DNA-fragmenttien kloonaus on suosittu menetelmä kyseisen DNA-osan rakenteen ja toiminnan tutkimiseen.
Molekyylikloonauksen päätavoitteena on tehdä miljoonia kopioita geneettisesti identtisistä soluista tai organismeista, joissa on kiinnostavaa DNA-fragmenttia (lähinnä geenejä). Se luo organismeja, joilla on tarkat geneettiset kopiot toisesta. Ensisijaisesti spesifiset geenit kloonataan molekyylitutkimuksissa rakenteellisen ja toiminnallisen tiedon saamiseksi ja DNA-sekvensointia varten. Kloonausta käytetään myös laajalti spesifisten proteiinien tai tuotteiden tuotantoon laajamittaisesti.
Kloonausmenettely
Kloonausmenettelyn perusvaiheet ovat seuraavat.
- Kiinnostuksen kohteena olevan geenin tunnistaminen ja eristäminen. (Kiinnostuksen kohteena olevan geenin amplifikaatio PCR: llä).
- Kiinnostuksen kohteena olevan geenin rajoittava pilkkominen (restriktioendonukleaasi katkaisi geenin).
- Vektori-DNA: n rajoittava pilkkominen. (Vektori-DNA leikataan myös käyttämällä samaa restriktioendonukleaasia).
- Geenin insertio vektoriin ja rekombinanttimolekyylin muodostuminen.
- Rekombinanttivektorin transformaatio isäntäbakteeriksi.
- Transformoitujen bakteerien eristäminen ja tunnistaminen (plasmidivektorin tulisi sisältää valittavissa oleva geeni, yleisimmin antibioottiresistenssigeeni transformoitujen bakteerien seulomiseksi).
- Rekombinantti geeniekspressio isännässä.
Kuva_01: Kloonausmenettely
Mikä on subkloonaus?
Alikloonaus on menetelmä kiinnostavan geenin siirtämiseksi yhdestä vektorista toiseen vektoriin geenin ilmentymisen näkemiseksi geenin halutun toiminnallisuuden saavuttamiseksi. Tässä menetelmässä on mukana kaksi vektoria; nimittäin emovektori ja kohdevektori. Kloonatut insertit siirretään taas toiseen vektoriin alakloonauksessa. Geenin siirtämisen ensimmäisestä vektorista toiseen vektoriin tavoitteena on saada jotain, mitä ensimmäinen vektori ei voinut tehdä, tai erottaa geeni uudelleen jo kloonatun DNA-fragmentin sisällä ja ilmentää se yksin. Rajoitusentsyymejä käytetään tässä menettelyssä alussa.
Subkloonausmenettely
Alikloonauksen perusvaiheet ovat seuraavat.
- Restriktioendonukleaasien avulla kiinnostuksen kohteena olevan DNA: n erottaminen luovuttajaplasmidissa (kantavektori).
- Kiinnostavan DNA: n monistus PCR: llä.
- PCR-tuotteen (mielenkiinnon kohteena olevan DNA: n) puhdistus geelielektroforeesilla.
- Vastaanottajaplasmidin avaaminen samoilla restriktioendonukleaaseilla, joita käytetään erottamaan kiinnostava DNA emoplasmidissa.
- Kiinnostavan DNA: n (geenin) ligaatio vastaanottajaplasmidiin alakloonatun plasmidin luomiseksi.
- Subkloonatun vektorin transformaatio kompetenssiksi isäntäbakteeriksi.
- Transformoitujen solujen seulonta.
- Plasmidi-DNA: n puhdistus ja käyttö DNA-sekvensointiin tai geenien ilmentämiseen haluttujen tuotteiden saamiseksi.
Alikloonaus suoritetaan silloin, kun yksi geeni eristetään kloonatusta geeniryhmästä tai kun mielenkiinnon kohteena olevan geenin on siirryttävä käyttökelpoiseen plasmidiin kiinnostavan geenin tarkan toiminnan havaitsemiseksi.
Kuva_02: Alikloonausmenettely
Mitä eroa on kloonauksella ja alakloonauksella?
Erilainen artikkeli keskellä taulukkoa
Kloonaus vs alakloonaus |
|
| Kloonaus on menettely, joka tuottaa geneettisesti identtisiä organismeja tai soluja. | Alikloonaus on menetelmä kiinnostavan geenin siirtämiseksi yhdestä vektorista toiseen vektoriin geenin ilmentymisen näkemiseksi geenin halutun toiminnallisuuden saavuttamiseksi. |
| Käsitellä asiaa | |
| Erota kiinnostava DNA organismista ja insertoidaan vektoriin kerran ja kloonataan | Jo kloonattu DNA erotetaan ensimmäisestä vektorista ja insertoidaan toiseen vektoriin ja kloonataan. |
| Lisää liike vektorien kautta | |
| Ei siirrä inserttejä (kiinnostavaa DNA: ta) vektorista toiseen vektoriin. | Siirrä insertit vanhemmasta vektorista kohdevektoriin. |
Yhteenveto - kloonaus vs alakloonaus
Kloonaus luo geneettisesti identtiset solut tai organismit kiinnitetyn geenin tai DNA: n kanssa. Se etenee kiinnostuksen kohteena olevan DNA: n erottamisen ja insertoinnin kautta vektoriin ja ilmentämisen isäntäbakteerissa. Alikloonaus jakaa samanlaiset vaiheet kloonauksen kanssa. Alikloonauksessa kuitenkin jo kloonattu DNA-fragmentti (mielenkiinnon kohteena oleva geeni) insertoidaan vektoriin ja transformoidaan isäntäbakteeriksi. Se on tärkein ero kloonauksen ja alakloonauksen välillä.
