Tärkein ero - PCR-alukkeet vs. sekvensointialukkeet
Molekyylibiologian viimeaikaisen kehityksen myötä kehitettiin erilaisia geenitekniikoita, jotka tekivät kohteen eri keinojen tutkimusprosessit helpoksi ja tarkaksi. PCR ja muut sekvensointimenettelyt ovat kaksi tärkeätä tällaista tekniikkaa. He käyttävät erilaisia alaosia. Alukkeita pidetään tärkeimpänä alikomponenttina, joka on yhteinen sekä PCR- että sekvensointitekniikoille. PCR-alukkeita käytetään tietyn DNA-sekvenssin monistamiseen, kun taas sekvensointialukkeita käytetään DNA-fragmentin sekvensoinnin yhteydessä tarkoituksena paljastaa sen nukleotidisekvenssin spesifinen järjestys. Tämä on keskeinen ero PCR-alukkeiden ja sekvensointialukkeiden välillä.
SISÄLLYS
1. Yleiskatsaus ja keskeinen ero
2. Mitä ovat PCR-alukkeet
3. Mitä ovat sekvensointialukkeet
4. Samankaltaisuudet PCR-alukkeiden ja sekvensointialukkeiden välillä
5. Rinnakkainen vertailu - PCR-alukkeet vs. sekvensointialukkeet taulukkomuodossa
6. Yhteenveto
Mitä ovat PCR-alukkeet?
Polymeraasiketjureaktio (PCR) on geneettinen tekniikka, jota käytetään molekyylibiologian alalla yhden tai muutaman kopion monistamiseksi tietystä DNA-segmentistä ja monien miljoonien identtisten kopioiden saamiseksi. PCR-reaktiossa käytetään erilaisia komponentteja, mukaan lukien alukkeet. Alukkeet ovat lyhyitä DNA-juosteita, joiden nukleotidipituus on 18-25, mikä tekee niistä yhteensopivia monistettavien DNA-fragmenttien alku- ja loppuosan kanssa. Alukkeet voivat olla eteenpäin suuntautuva aluke ja käänteinen aluke. Nämä alukkeet sitoutuvat DNA-fragmenttiin tietyissä kohdissa, joissa se saa DNA-polymeraasin sitoutumaan spesifiseen alukkeeseen sijainnissaan ja aloittamaan uuden DNA-juosteen synteesin.
Alukkeiden valinta on tärkeä osa PCR-prosessia. Alukkeen pituuden valinta on tärkeää. Ihanteellinen pituus olisi 18-25 nukleotidia. Jos pituus on liian lyhyt tai liian pitkä, alukkeet eivät sitoutu tarkasti monistettavaan DNA-sekvenssiin. Liian lyhyet alukkeet johtavat epäspesifisen alukkeen pariutumiseen DNA-sekvenssin eri paikoissa.
Kuva 01: PCR-alukkeet
Hyvän alukkeen guaniini- ja sytosiinipitoisuuden (GC) tulisi olla välillä 40-60. Alukkeen hehkutuslämpötila ja sulamislämpötila ovat elintärkeitä tekijöitä PCR: n aikana. Sulamislämpötila tulisi laskea tarkasti ja alukkeen hehkutuslämpötilan tulisi olla 5 0 C pienempi kuin sulamislämpötila. Sulamislämpötilan tulisi olla 60 ° C ja 75 ° C. Liian korkeat tai matalat lämpötilat johtavat vähemmän aktiiviseen DNA-polymeraasiaktiivisuuteen.
Mitä ovat sekvensointialukkeet?
Sekvensointialukkeita käytetään DNA-fragmentin sekvensoinnin yhteydessä sen spesifisen identiteetin paljastamiseksi. Hyvien sekvensointitulosten saamiseksi tärkeitä ovat korkealaatuiset alukkeet ja templaatit. Siksi, kun alukkeet valitaan, niiden tulisi olla ainutlaatuisia tietylle alueelle, jolla haluamme sekvensoida. Sen tulisi myös olla oikeassa suunnassa, jossa sekvenssit muodostetaan yleensä alukkeiden 3'-5'-päästä. Sekvenssistä ei saisi puuttua ei-toivottua itsehybridisaatiota, kuten hiusneulasilmukoiden muodostumista. Se ei saisi sisältää peräkkäistä guaniiniemästen muodostumista.
Alukkeen sulamislämpötilan (Tm) on oltava sopiva sekvensointiolosuhteisiin. Siksi sen tulisi olla välillä 52 oC - 74 oC. Alukkeena käytettävien oligonukleotidien valmistus tulisi puhdistaa halutun sekvenssin koko pituuden saamiseksi. Jos oligonukleotidit sisältävät epäpuhtauksia, alukesekvenssin signalointi asetetaan päällekkäin eri aloituspaikoista, ja se vähentää myös emässolujen määrää.
Kuva 02: Sekvensointialukkeet
Oligonukleotidin alukkeen sulamislämpötila (Tm) määrittää, kuinka voimakkaasti komplementaariset DNA-juosteet hybridisoituvat keskenään. Tm: ää voidaan pitää termodynaamisena laskelmana, jossa se riippuu sekä DNA-sekvensseistä että useista olosuhteista, kuten suolapitoisuudesta. Tm on tärkeä PCR: n aikana, jossa syklisekvensointia kutsuttua muunnosta käytetään dideoksinukleotidipäätteisten fragmenttien ryhmän tuottamiseen. Tällöin sekvensoitu aluke hehkutetaan aluksi vaihtoehtoisesti, sitten laajennetaan ja denaturoidaan viimeiseksi monistusta varten. Siksi Tm-arvon tulisi olla välillä 52 oC - 74 oC. Syntetisoituja oligonukleotideja voidaan saada DNA / RNA-synteesilaboratorioista valinnan mukaan. DNA-sekvensointiin käytetty pieni synteesimittakaava on yleensä 50 nmol. Tärkeintä on myös, että sekvensointiin käytetyt alukkeet tulisi puhdistaa siten, ettei niissä ole epäpuhtauksia, jotka estävät laadun heikkenemisen.
Mitkä ovat yhtäläisyydet PCR-alukkeiden ja sekvensointialukkeiden välillä?
- Sekä PCR-alukkeet että sekvensointialukkeet ovat alukkeita, joita käytetään kohdennetun DNA-sekvenssin monistusprosessissa.
- Sekä PCR-alukkeet että sekvensointialukkeet koostuvat nukleotideista.
- Sekä PCR-alukkeet että sekvensointialukkeet ovat lyhyitä oligomeereja.
Mikä on ero PCR-alukkeiden ja sekvensointialukkeiden välillä?
Erilainen artikkeli keskellä taulukkoa
PCR-alukkeet vs sekvensointialukkeet |
|
| PCR-alukkeet ovat lyhyitä DNA-juosteita, joiden nukleotidisekvenssin pituus on 18-25, mikä tekee niistä yhteensopivia monistettavien DNA-fragmenttien alku- ja loppuosan kanssa. | Sekvensointialukkeet ovat lyhyitä oligomeereja, joita käytetään DNA-fragmentin sekvensoinnin yhteydessä tarkoituksena paljastaa sen spesifinen identiteetti. |
| Toiminto | |
| PCR-alukkeita käytetään tietyn DNA-sekvenssin monistamiseen. | Sekvensointialukkeita käytetään DNA-fragmentin sekvensoinnin yhteydessä sen spesifisen identiteetin paljastamiseksi. |
| Tarvittavien alukkeiden määrä | |
| Kaksi aluketta; yhtä eteenpäin tulevaa aluketta ja yhtä käänteistä aluketta käytetään PCR-alukkeina. | Tarvitaan vain yksi aluke sekvensointialustana. |
Yhteenveto - PCR-alukkeet vs. sekvensointialukkeet
Sekvensointialukkeita käytetään DNA-fragmentin sekvensoinnin yhteydessä sen spesifisen identiteetin paljastamiseksi. Yksi sekvensointialuke riittää prosessin suorittamiseen. Hyvien sekvensointitulosten saamiseksi korkealaatuiset alukkeet ja templaatit ovat tärkeitä. Siksi, kun alukkeet valitaan, niiden tulisi olla ainutlaatuisia tietylle alueelle, jolla haluamme sekvensoida. PCR-alukkeet ovat lyhyitä DNA-juosteita, joiden nukleotidipituus on 18-25 ja joka on yhteensopiva monistettavien DNA-fragmenttien alku- ja loppuosan kanssa. PCR-alukkeet voivat olla eteenpäin suuntautuva aluke ja käänteinen aluke. Hyvän alukkeen guaniini- ja sytosiinipitoisuuden (GC) tulisi olla välillä 40-60. Alukkeen hehkutuslämpötila ja sulamislämpötila ovat elintärkeitä näkökohtia PCR: n aikana. Tämä on ero PCR-alukkeiden ja sekvensointialukkeiden välillä.
