Ero Pohjoisen Eteläisen Ja Länsimaisen Blottauksen Välillä

2024 Kirjoittaja: Mildred Bawerman | [email protected]. Viimeksi muokattu: 2023-12-16 08:38

Tärkein ero - Pohjoinen vs. etelä vs länsi-blotting

DNA: n, RNA: n ja proteiinien spesifisten sekvenssien havaitseminen on välttämätöntä erityyppisille molekyylibiologian tutkimuksille. Geelielektroforeesi on tekniikka, joka erottaa DNA: n, RNA: n ja proteiinit niiden koon mukaan. Geeliprofiileista tietty DNA-sekvenssi, RNA-sekvenssi tai proteiini havaitaan erityisillä tekniikoilla, joita kutsutaan blottaukseksi ja hybridisaatioksi leimattujen koettimien kanssa. Blottausmenetelmiä on kolme erilaista, nimittäin etelä-, pohjois- ja läntinen menetelmä. Keskeinen ero pohjoisen eteläisen ja länsimaisen blottauksen välillä on sen molekyylin tyypissä, jonka se havaitsee näytteestä. Southern-blottaus on menetelmä, joka havaitsee tietyn DNA-sekvenssin DNA-näytteestä. Northern blotting on tekniikka, joka havaitsee spesifisen RNA-sekvenssin RNA-näytteestä. Western blotting on menetelmä, joka havaitsee spesifisen proteiinin proteiininäytteestä.

SISÄLLYSLUETTELO

1. Yleiskatsaus ja keskeinen ero

2. Mikä on Southern Blotting

3. Mikä on Northern Blotting

4. Mikä on Western Blotting

5. Rinnakkainen vertailu - Northern vs Southern vs Western Blotting

6. Yhteenveto

Mikä on Southern Blotting?

Southern-blottaustekniikan kehitti EM Southern vuonna 1975 tietyn DNA-sekvenssin tunnistamiseksi DNA-näytteestä. Tämä on ensimmäinen blottaustekniikka, joka on otettu käyttöön molekyylibiologiassa. Se mahdollisti spesifisten geenien havaitsemisen DNA: sta, spesifiset fragmentit DNA: sta jne. Southern-blottaustekniikassa on useita vaiheita. Ne ovat seuraavat.

1. DNA eristetään näytteestä ja hajotetaan restriktioendonukleaaseilla.
2. Hajotettu näyte erotetaan agaroosigeelielektroforeesilla.
3. Geelissä olevat DNA-fragmentit denaturoidaan yksittäisiksi juosteiksi käyttämällä alkalista liuosta.
4. Yksisäikeinen DNA siirretään nitroselluloosasuodatinmembraanille siirtämällä kapillaareja.
5. Siirretty DNA kiinnitetään kalvoon pysyvästi.
6. Kalvon kiinteä DNA hybridisoidaan leimattujen koettimien kanssa.
7. Sitoutumaton DNA pestään pois membraanista pesemällä.
8. Röntgenfilmi altistetaan kalvolle ja valmistetaan autoradiografi.

Southern-blottausta käytetään molekyylibiologian eri näkökohtiin. Se on hyödyllinen RFLP-kartoituksessa, rikostutkimuksissa, DNA-metylaatiossa geeniekspressiossa, mutatoitujen geenien havaitsemisessa geneettisissä häiriöissä, DNA-sormenjälkien ottamisessa jne.

Kuva 01: Southern Blotting -tekniikka

Mikä on Northern Blotting?

Northern-blottaus on menetelmä, joka on suunniteltu havaitsemaan näytteestä spesifinen RNA-sekvenssi tai mRNA-sekvenssi geeniekspression tutkimiseksi. Tämän tekniikan ovat kehittäneet Alwine, Kemp ja Stark vuonna 1979. Se eroaa lähi- ja länsi-blottaustekniikoista useiden vaiheiden vuoksi. Tämä tekniikka suoritetaan kuitenkin myös geelielektroforeesilla, blottauksella ja hybridisaatiolla spesifisillä leimattuilla koettimilla ja detektiolla. Northern-blottaustekniikka suoritetaan seuraavasti.

1. RNA uutetaan näytteestä ja erotetaan geelielektroforeesilla.
2. RNA siirretään geelistä blotting-kalvolle ja kiinnitetään.
3. Kalvoa käsitellään leimatulla koettimella, joka on valmistettu cDNA: sta tai RNA: sta (koetin on komplementaarinen näytteen tiettyyn sekvenssiin).
4. Koetinta inkuboidaan kalvon kanssa sitoutumaan tiettyyn sekvenssiin.
5. Sitomattomat koettimet pestään pois.
6. Hybridisoituneet fragmentit havaitaan autoradiografilla.

Northern blotting on tärkeä väline hybridisoituneen mRNA: n havaitsemisessa ja kvantifioinnissa, RNA: n hajoamisen tutkiminen, RNA: n puoliintumisajan arviointi, RNA: n silmukoinnin havaitseminen, geeniekspression tutkiminen jne.

Kuva 02: Northern Blotting

Mikä on Western Blotting?

Western-blottaus on menetelmä spesifisen proteiinin havaitsemiseksi proteiiniseoksesta käyttämällä leimattua vasta-ainetta. Siksi Western blot tunnetaan myös immunoblotina. Tämän tekniikan esittivät Towbin et ai. Vuonna 1979, ja se suoritetaan nyt rutiininomaisesti laboratorioissa proteiinianalyysiä varten. Vaiheet ovat seuraavat.

1. Proteiinit uutetaan näytteestä
2. Proteiinit erotetaan niiden koon mukaan käyttämällä polyakryyliamidigeelielektroforeesia
3. Erilliset molekyylit siirretään PVDF-kalvoon tai nitroselluloosakalvoon elektroporaatiolla
4. Kalvo on estetty epäspesifisen sitoutumisen suhteen vasta-aineisiin
5. Siirretyt proteiinit sitoutuvat primaariseen vasta-aineeseen (entsyymileimatut vasta-aineet).
6. Kalvo pestään epäspesifisesti sitoutuneiden primaaristen vasta-aineiden poistamiseksi
7. Sitoutuneet vasta-aineet havaitaan lisäämällä substraatti ja havaitsemalla muodostunut värillinen sakka

Western-blottaus on hyödyllinen havaittaessa anti-HIV-vasta-aineita ihmisen seeruminäytteessä. Western blotia voidaan käyttää myös vahvistavana testinä hepatiitti B -infektiolle ja lopullisena testinä hullun lehmän tautiin.

Kuva 03: Western blotting

Mitä eroa on Northern Southern- ja Western Blotting -laitteiden välillä?

Erilainen artikkeli keskellä taulukkoa

Pohjoinen vs etelä vs länsi-blotting
Havaittu molekyylityyppi
Northern Blotting	Northern-blottaus havaitsee spesifisen RNA-sekvenssin RNA-näytteestä.
Southern Blotting	Southern-blottaus havaitsee tietyn DNA-sekvenssin DNA-näytteestä.
Western Blotting	Western-blottaus havaitsee spesifisen proteiinin proteiininäytteestä.
Geelin tyyppi
Northern Blotting	Tässä käytetään agaroosi / formaldehydigeeliä.
Southern Blotting	Tämä käyttää Agarose-geeliä.
Western Blotting	Tässä käytetään polyakryyliamidigeeliä.
Blottausmenetelmä
Northern Blotting	Tämä on kapillaarisiirto.
Southern Blotting	Tämä on kapillaarisiirto.
Western Blotting	Tämä on sähköinen siirto.
Käytetyt koettimet
Northern Blotting	cDNA- tai RNA-koettimet leimattu radioaktiivisesti tai ei-radioaktiivisesti.
Southern Blotting	DNA-koettimet leimataan radioaktiivisesti tai ei-radioaktiivisesti.
Western Blotting	Primaarisia vasta-aineita käytetään koettimina.
Tunnistusjärjestelmä
Northern Blotting	Tämä tehdään käyttämällä autoradiografia tai valon tai värin muutoksen havaitsemista.
Southern Blotting	Tämä tehdään autoradiografilla, valon tai värin muutoksen havaitsemisella.
Western Blotting	Tämä tapahtuu käyttämällä valon tai värin muutoksen havaitsemista.

Yhteenveto - Northern vs Southern vs Western Blotting

Blottaus on erityinen tekniikka, joka on kehitetty spesifisen DNA: n, RNA: n tai proteiinin tunnistamiseksi näytteistä. On olemassa kolme erillistä blottausmenettelyä, nimittäin pohjoinen, etelä ja länsi tietyn tyyppisen molekyylin havaitsemiseksi. Northern-blottaustekniikka on suunniteltu havaitsemaan spesifinen RNA-sekvenssi RNA: n seoksesta. Southern-blottaustekniikka mahdollistaa spesifisen DNA-sekvenssin havaitsemisen DNA-näytteestä ja Western-blottaustekniikka kehitetään spesifisen proteiinin tunnistamiseksi proteiiniseoksesta.