Tärkein ero - Sanger-sekvensointi vs. pyrosekvensointi
DNA-sekvensointi on erittäin tärkeää DNA-analyysissä, koska tietämys oikeasta nukleotidijärjestelystä tietyllä DNA-alueella paljastaa monia tärkeitä tietoja siitä. DNA-sekvensointimenetelmiä on erilaisia. Sanger-sekvensointi ja pyrosekvensointi ovat kaksi erilaista DNA-sekvensointimenetelmää, joita käytetään laajalti molekyylibiologiassa. Keskeinen ero Sanger-sekvensoinnin ja pyrosekvensoinnin välillä on se, että Sanger-sekvensointi käyttää dideoksynukleotideja lopettaakseen DNA-synteesin nukleotidisekvenssin lukemiseksi, kun taas pyrosekvensointi havaitsee pyrofosfaatin vapautumisen sisällyttämällä nukleotidit ja syntetisoimalla komplementaarisen sekvenssin sekvenssin tarkan järjestyksen lukemiseksi.
SISÄLLYSLUETTELO
1. Yleiskatsaus ja keskeinen ero
2. Mikä on Sanger-sekvensointi
3. Mikä on pyrosekvensointi
4. Vertailu rinnakkain - Sanger-sekvensointi vs Pyrosekvensointi
5. Yhteenveto
Mikä on Sanger-sekvensointi?
Sangerin sekvensointi on ensimmäisen sukupolven DNA-sekvensointimenetelmä, jonka Frederick Sanger ja hänen korkeakoulut kehittivät vuonna 1977. Se tunnetaan myös nimellä Chain Termination Sequencing tai Dideoxy sekvensointi, koska se perustuu ketjun lopettamiseen dideoksynukleotidien (ddNTP) avulla. Tätä menetelmää käytettiin laajalti yli 30 vuoden ajan, kunnes uuden sukupolven sekvensointi (NGS) kehitettiin. Sanger-sekvensointitekniikka mahdollisti oikean nukleotidijärjestyksen löytämisen tai tietyn DNA-fragmentin kiinnittymisen. Se perustuu ddNTP: iden selektiiviseen sisällyttämiseen ja DNA-synteesin lopettamiseen in vitro DNA-replikaation aikana. 3'-OH-ryhmien puuttuminen fosfodiesterisidoksen muodostumisen jatkamiseksi vierekkäisten nukleotidien välillä on ddNTP: iden ainutlaatuinen piirre. Siksi, kun ddNTP on kiinnittynyt, ketjun venymä loppuu ja päättyy tuosta pisteestä. Sanger-sekvensoinnissa käytetään neljä ddNTP: tä - ddATP, ddCTP, ddGTP ja ddTTP. Nämä nukleotidit pysäyttävät DNA-replikaatioprosessin, kun ne on sisällytetty kasvavaan DNA-juosteeseen, ja niiden seurauksena lyhyt DNA vaihtelee. Kapillaarigeelielektroforeesia käytetään näiden lyhyiden DNA-juosteiden järjestämiseen niiden koon mukaan geelillä, kuten kuvassa 01 on esitetty.
Kuva 1: Syntetisoidun lyhyen DNA: n kapillaarigeelielektroforeesi
DNA: n in vitro -replikaatiota varten tulisi asettaa muutama vaatimus. Ne ovat DNA-polymeraasientsyymi, templaatti-DNA, oligonukleotidialukkeet ja deoksinukleotidit (dNTP). Sanger-sekvensoinnissa DNA-replikaatio suoritetaan neljässä erillisessä koeputkessa yhdessä neljän tyyppisen ddNTP: n kanssa erikseen. Deoksinukleotidit eivät ole täysin korvattu vastaavilla ddNTP: llä. Seos tietystä dNTP: stä (esimerkiksi; dATP + ddATP) lisätään putkeen ja replikoidaan. Neljä erillistä putkituotetta ajetaan geelillä neljässä erillisessä kuopassa. Sitten lukemalla geeli, sekvenssi voidaan muodostaa kuvan 02 mukaisesti.
Kuva 02: Sanger-sekvensointi
Sanger-sekvensointi on tärkeä tekniikka, joka auttaa monilla molekyylibiologian aloilla. Ihmisen genomiprojekti saatiin onnistuneesti päätökseen Sanger-sekvensointiin perustuvien menetelmien avulla. Sanger-sekvensointi on hyödyllinen myös kohde-DNA-sekvensoinnissa, syövän ja geneettisten tautien tutkimuksessa, geeniekspressioanalyysissä, ihmisen tunnistamisessa, patogeenien havaitsemisessa, mikrobien sekvensoinnissa jne.
Sanger-sekvensoinnissa on useita haittoja:
- Sekvensoidun DNA: n pituus ei voi olla yli 1000 emäsparia
- Vain yksi juoste voidaan sekvensoida kerrallaan.
- Prosessi on aikaa vievä ja kallis.
Siksi kehitettiin uusia edistyneitä sekvensointitekniikoita ajan myötä näiden ongelmien voittamiseksi. Sanger-sekvensointi on kuitenkin edelleen käytössä, koska sen tarkat tulokset ovat jopa noin 850 emäsparin pituista fragmenttia.
Mikä on pyrosekvensointi?
Pyrosekvensointi on uusi DNA-sekvensointitekniikka, joka perustuu “sekvensointiin synteesillä”. Tämä tekniikka perustuu pyrofosfaatin vapautumisen havaitsemiseen nukleotidin sisällyttämisen yhteydessä. Menetelmää käyttävät neljä erilaista entsyymiä: DNA-polymerse, ATP-sulfurylaasi, lusiferaasi ja apyraasi ja kaksi substraattia adenosiini-5'-fosfosulfaatti (APS) ja lusiferiini.
Prosessi alkaa alukkeen sitoutumisesta yksijuosteisella DNA-templaatilla ja DNA-polymeraasi aloittaa sille komplementaaristen nukleotidien liittämisen. Kun nukleotidit liittyvät yhteen (nukleiinihappopolymerointi), se vapauttaa pyrofosfaatti- (kaksi yhteen sitoutunutta fosfaattiryhmää) ja energiaa. Jokainen nukleotidilisäys vapauttaa ekvimolaarisen määrän pyrofosfaattia. Pyrofosfaatti muuttuu ATP: ksi ATP-sulfurylaasilla substraatti APS: n läsnä ollessa. Muodostettu ATP ajaa lusiferaasin välittämää lusiferiinin muuntumista oksyylisiferiiniksi tuottamalla näkyvää valoa määrinä, jotka ovat verrannollisia ATP: iden määrään. Valo havaitaan fotonien havaitsemislaitteella tai fotokertoimella ja luo pyrogrammin. Apyraasi hajottaa ATP: tä ja integroimattomia dNTP: itä reaktioseoksessa. dNTP: n lisäys tehdään kerran kerrallaan. Koska nukleotidin lisäys tunnetaan valon sisällyttämisen ja havaitsemisen perusteella, templaatin sekvenssi voidaan määrittää. Pyrogrammia käytetään näyte-DNA: n nukleotidisekvenssin muodostamiseen kuvan 03 mukaisesti.
Pyrosekvensointi on erittäin tärkeää yksittäisen nukleotidin polymorfismianalyysissä ja lyhyiden DNA-jaksojen sekvensoinnissa. Suuri tarkkuus, joustavuus, automatisoinnin helppous ja rinnakkainen käsittely ovat pyrosekvensoinnin etuja verrattuna Sangerin sekvensointitekniikoihin.
Kuva 03: Pyrosekvensointi
Mitä eroa on Sanger-sekvensoinnilla ja pyrosekvensoinnilla?
Erilainen artikkeli keskellä taulukkoa
Sanger-sekvensointi vs pyrosekvensointi |
|
| Sanger-sekvensointi on DNA-sekvensointimenetelmä, joka perustuu ddNTP: iden selektiiviseen liittämiseen DNA-polymeraasilla ja ketjun päätteellä. | Pyrosekvensointi on DNA-sekvensointimenetelmä, joka perustuu pyrofosfaatin vapautumisen havaitsemiseen nukleotidin sisällyttämisen yhteydessä. |
| DdNTP: n käyttö | |
| ddNTP: itä käytetään lopettamaan DNA-replikaatio | ddNTP: itä ei käytetä. |
| Entsyymit mukana | |
| DNA-polymeraasia käytetään. | Käytetään neljää entsyymiä: DNA-polymeraasi, ATP-sulfurylaasi, lusiferaasi ja Apyraasi. |
| Käytetyt alustat | |
| APS: ää ja lusiferiinia ei käytetä. | Käytetään adenosiini-5'-fosfosulfaattia (APS) ja lusiferiinia. |
| Suurin lämpötila | |
| Tämä on hidas prosessi. | Tämä on nopea prosessi. |
Yhteenveto - Sangerin sekvensointi vs pyrosekvensointi
Sanger-sekvensointi ja pyrosekvensointi ovat kaksi molekyylibiologiassa käytettyä DNA-sekvensointimenetelmää. Sanger-sekvensointi rakentaa nukleotidien järjestyksen peräkkäin lopettamalla ketjun venymän, kun taas pyrosekvensointi rakentaa nukleotidien tarkan järjestyksen peräkkäin sisällyttämällä nukleotidit ja havaitsemalla pyrofosfaattien vapautumisen. Siksi tärkein ero Sanger-sekvensoinnin ja pyrosekvensoinnin välillä on se, että Sanger-sekvensointi toimii sekvensoinnilla ketjun lopetuksella, kun taas pyrosekvensointi toimii sekvensoinnilla synteesin avulla.
